CD34+造血干細(xì)胞是血液系統(tǒng)中的關(guān)鍵細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能。通過轉(zhuǎn)染技術(shù)，可以研究基因功能并開發(fā)新的治療策略。ProteanFect Max作為一種高效的轉(zhuǎn)染試劑，已被證明能顯著提高mRNA轉(zhuǎn)染效率，且對細(xì)胞分化影響較小。
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2. 材料與方法
2.1 CD34+造血干細(xì)胞的分選
使用動(dòng)員人單采血或臍帶血，通過陽性選擇分選試劑盒分離CD34+細(xì)胞。推薦使用Lymphoprep?（Stemcell, 07861）作為分離試劑，以及CD34 MicroBead Kit, human（Miltenyi Biotec, 130-046-702）進(jìn)行細(xì)胞分選。
2.2 培養(yǎng)基的配制
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SFEM II培養(yǎng)基（Stemcell, 09655）和StemSpan? CC100（Stemcell, 02690）以99:1比例混合。
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若添加抗生素，需稀釋1000倍。
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配制完成后，培養(yǎng)基應(yīng)放置于4°C冰箱儲(chǔ)存，并盡量在1個(gè)月內(nèi)使用完。
2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代
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分選后的CD34+細(xì)胞以300g離心5分鐘，用1 mL完全培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)。
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根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞重懸至105 cells/mL的密度，接種到T25培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板中。
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3天后補(bǔ)液一次，若進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，需調(diào)整細(xì)胞密度至2×105 cells/mL，并隔天補(bǔ)液。
2.4 轉(zhuǎn)染操作
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轉(zhuǎn)染核酸：mRNA。
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轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基：使用Opti-MEM培養(yǎng)基或無血清RPMI 1640/無血清DMEM培養(yǎng)基。
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轉(zhuǎn)染體系：配置ProteanFect Max轉(zhuǎn)染體系，具體protocol需參考私戳獲取。
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細(xì)胞準(zhǔn)備：確保細(xì)胞活率超過90%，避免反復(fù)離心。
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轉(zhuǎn)染過程：孵育時(shí)間建議15分鐘，適當(dāng)延長可提高轉(zhuǎn)染率，但可能影響細(xì)胞活力。
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效率檢測：使用陽性對照mRNA，轉(zhuǎn)染后5-48小時(shí)內(nèi)觀察EGFP表達(dá)。細(xì)胞活率可通過鏡下觀察、臺盼藍(lán)、AO/PI染色或流式細(xì)胞術(shù)檢測。
3. 結(jié)果
使用ProteanFect Max轉(zhuǎn)染的CD34+造血干細(xì)胞顯示出高達(dá)72.3%的mCherry+表達(dá)率，而未處理組僅為0.25%。此外，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的分化狀態(tài)未受顯著影響，CD71+CD235-細(xì)胞比例在轉(zhuǎn)染后第2天和第3天保持穩(wěn)定。
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