單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測序的一項(xiàng)技術(shù)。

獲得高覆蓋度高保真性的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物是準(zhǔn)確全面的測序結(jié)果的保障。為了保證基因組高覆蓋度無偏好性的擴(kuò)增，在單細(xì)胞測序技術(shù)誕生的近二十年時間里，全基因組擴(kuò)增技術(shù)經(jīng)歷了幾次重大的變革。

WGA主要有三種方式：DOP-PCR，MDA，MALBAC。

下面小編就來為大家介紹一下WGA技術(shù)的演變歷程，以及怎樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的擴(kuò)增方式。

技術(shù)原理：簡并寡核苷酸引物PCR，引物的3′?含6bp的隨機(jī)序列，可以隨機(jī)的和基因組DNA結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對全基因組的擴(kuò)增。

應(yīng)用范圍：因?yàn)镻CR的指數(shù)擴(kuò)增特性，放大了基因組上不同序列之間的差異，因而導(dǎo)致擴(kuò)增出的基因組覆蓋度較低。盡管如此，在1M bin size的水平上，DOP-PCR適合對染色體的CNV進(jìn)行定量。

商品化試劑盒：Sigma-Aldrich, GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit。

技術(shù)原理：2001年由Laskin團(tuán)隊(duì)發(fā)明，使用隨機(jī)的六聚體引物和φ29DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，該聚合酶具有很強(qiáng)的鏈置換特性，能夠在等溫的條件下，擴(kuò)增產(chǎn)生50~100kb的核酸片段。同時由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對活性，φ29 DNA聚合酶具有很高的復(fù)制保真性。應(yīng)用范圍：MDA法比DOP-PCR擁有更高的基因組覆蓋度，φ29 DNA聚合酶的高效率及高保真性，使得MDA法在對SNV的分析，以及構(gòu)建大片段文庫上有著顯著優(yōu)勢。但是，和DOP-PCR相同，MDA法依然是指數(shù)擴(kuò)增，因此依然存在PCR反應(yīng)的序列偏好性，然而，和DOP-PCR不同的是，這種偏好性并不能重復(fù)，因此MDA法不適合進(jìn)行CNV的分析。

商品化試劑盒：Qiagen,?REPLI-g?Single?Cell?Kit。?

技術(shù)原理：2012年由謝曉亮團(tuán)隊(duì)發(fā)明，擬線性的擴(kuò)增過程降低了指數(shù)擴(kuò)增的序列偏好性。擴(kuò)增引物的5’含有27bp的共同序列，3’是8bp的隨機(jī)序列，可以和模板在15~20℃的低溫下結(jié)合，經(jīng)過8~12個循環(huán)的擬線性擴(kuò)增后，再對這些環(huán)狀的擴(kuò)增子進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。應(yīng)用范圍：MALBAC法的優(yōu)勢在于，雖然它依然存在一定的序列偏好性，但和MDA不同，MALBAC的這種偏好性在不同的細(xì)胞之間是可重復(fù)的，因此可以通過對參考細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行CNV的分析；另外，由于其擴(kuò)增的均一性，MALBAC法擴(kuò)增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱點(diǎn)在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29，因此MALBAC在檢測SNV時將會出現(xiàn)更多的假陽性；另外，由于它可重復(fù)性的序列偏好性，基因組上低擴(kuò)增的區(qū)域有時會在擴(kuò)增過程中丟失。

商品化試劑盒：Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit; Rubicon, PicoPLEX WGA Kit。

由上述的分析可見，MDA和MALBAC各有優(yōu)劣，實(shí)際上在不同的文獻(xiàn)中，研究者也會根據(jù)研究目的的不同，采取不同的方式對基因組進(jìn)行擴(kuò)增，以滿足研究的需要。

PicoPLEX^??WGA Kit：用于單細(xì)胞文庫構(gòu)建的全基因組擴(kuò)增解決方案

PicoPLEX^??DNA-seq Kit：單細(xì)胞 DNA 文庫制備技術(shù)，適用于 Illumina 所有 NGS 測序平臺

ThurPLEX^??DNA-seq Kit：更高的通量, 更好的性能, 用于所有 Illumina 的 NGS 平臺

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