以肝臟細胞為模型的實驗越來越受到重視，在肝臟病變機理研究、藥物代謝研究、藥物毒理評估等方面有廣闊的應用前景。然而，以個體原代肝細胞為材料來源會產生如取材困難、材料批間差大、無法長期穩(wěn)定供應等一系列難以克服的問題。因此，通過iPS批量轉化生產肝細胞的方法就顯示出特別的優(yōu)勢。Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System可以穩(wěn)定地、規(guī)?；貙崿F(xiàn)iPS向hepatocyte的誘導轉化生產，而且誘導轉化出的肝細胞能夠穩(wěn)定表達藥物代謝相關酶系統(tǒng)和藥物轉運系統(tǒng)。

人類iPS細胞向肝細胞分化的簡單而通用的系統(tǒng)
Cellartis細胞iPS向肝細胞分化系統(tǒng)是一個完整的系統(tǒng)，包括所有培養(yǎng)基、補充劑和將任何iPS細胞系分化為肝細胞的方案(Laydon, Bangham, and Asquith 2015)。該方案模擬體內肝臟發(fā)育:iPS細胞首先分化為最終內胚層(DE)細胞，然后進一步分化為成熟肝細胞。分化成熟肝細胞在分化第21天準備好用于您的研究應用，并且具有至少11天的實驗時間窗口。

iPS細胞到肝細胞分化系統(tǒng)概述。完整的系統(tǒng)包括培養(yǎng)基、補充物和將任何iPS細胞系分化為肝細胞的方案。

培養(yǎng)效果：

從hiPS細胞系中衍生同質終代內胚層細胞。A. RT-qPCR分析顯示，DE細胞中干細胞標志物OCT4 (A1)和NANOG (A2)的表達下調。與未分化的hiPS細胞相比，DE細胞中DE標記物CXCR4 (A3)和SOX17 (A4)的mRNA表達強烈上調。胚胎外標記物SOX7 (A5)的低表達表明胚胎外內胚層細胞極少發(fā)生。b組DE標記物SOX17 (B2, B5)和干細胞標記物OCT4 (B3, B6)的免疫細胞化學染色顯示，來自hiPS細胞系ChiPSC6b和P11025的DE細胞中存在少量OCT4免疫陽性細胞核，而大多數(shù)SOX17免疫陽性細胞核。細胞核用DAPI染色(B1, B4)。

實驗方法：
方法
iPS細胞向肝細胞的分化
分化方案由Asplund等人于2016年發(fā)布，并對成熟階段進行了一些修改(Laydon, Bangham, and Asquith 2015)。簡單地說，iPS細胞在DEF-CS中以確定的細胞密度在第0天的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在接下來的7天內，培養(yǎng)基變化產生均勻的DE細胞，然后酶解并重新鍍上進一步的肝細胞分化。肝細胞分化培養(yǎng)基引導DE細胞在體內經(jīng)歷與肝臟發(fā)育相同的發(fā)育階段:腹前腸、肝母細胞、胎兒樣肝細胞和成熟肝細胞。這個過程還需要兩個星期。在這個過程的最后，提供的肝細胞維持培養(yǎng)基允許功能維持至少11天。

免疫細胞化學
細胞用抗hnf4 α一抗(Santa Cruz Biotechnology)染色，然后用驢抗兔二抗染色，用DAPI反染色(Laydon, Bangham, and Asquith 2015)。將代表性的hnf – α圖像與DAPI合并，并對hnf – α-DAPI雙陽性核的數(shù)量進行評價。

RT-qPCR
使用OCT4 (Hs01654807_s1)、NANOG-1 (Hs02387400_g1)、SOX17(Hs00751752_s1)、CXCR4(Hs00237052_m1)、SOX7(Hs00846731_s1)、CREBBP (Hs00231733_m1)、AFP (Hs00173490_m1)、Albumin (Hs00910225_m1)、CYP1A2 (Hs01070374_m1)、CYP2C9 (Hs004260376_m1)和CYP3A4 (Hs00604506_m1) TaqMan探針(Applied Biosystems)進行分析。使用ΔΔCt方法計算表達水平，歸一化為CREBBP表達。

CYP活性測定
細胞用不含酚紅的溫水水洗兩次(Thermo Fisher Scientific)。溫式WME中加入26μM非那西丁(CYP1A)、50μM甲苯妥英(CYP2C19)、9μM雙氯芬酸(CYP2C9)和3μM咪達唑侖(CYP3A)，并添加0.1% PEST、25 mM HEPES和2 mM l -谷氨酰胺。2h后，收集100μl上清，-80℃保存，待LC/MS分析撲熱息痛、羥基甲苯妥英、羥基雙氯芬酸和羥基咪達唑侖。用Pierce BCA蛋白測定試劑盒(Thermo Fisher Scientific)定量每孔的蛋白量。代謝物濃度按每孔蛋白量和測定時間歸一化。

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Y30055 Cellartis? iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System 1 Kit